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侖昌碩生物???小鼠細胞間粘附分子1（ICAM-1;CD54）elisa試劑盒

? ? ?目的: 觀察鐵調(diào)節(jié)蛋白2(Iron Regulatory Protein2,Irp2)基因敲除小鼠體內(nèi)鐵代謝和骨代謝的改變,探討鐵代謝紊亂在老年小鼠骨質(zhì)疏松癥發(fā)病中的作用及其機制. 方法: 本課題擬利用15月齡鐵調(diào)節(jié)蛋白2基因敲除C57BL/6雌性小鼠(Irp2-/-,內(nèi)源性鐵過載模型)為研究對象,另外選擇6只同月齡健康雌性野生型(Irp2 / )小鼠作為對照組.取小鼠第6腰椎行Micro CT并三維重建;對第6腰椎進行骨組織切片,并行普魯士藍鐵染色及HE染色,觀察骨組織鐵沉積情況和骨組織的結(jié)構(gòu)變化;采用原子吸收光譜法檢測小鼠第6腰椎骨鐵,骨鈣,骨磷以及小鼠肝鐵含量;Realtime PCR法檢測骨組織中鐵代謝相關(guān)基因[膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白1(Ferroportin-1, Fpn1),轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1(Transferrin receptor-1, Tfr1),鐵蛋白輕鏈(Ferritin light chain, Ftl),鐵調(diào)素(Hepcidin)],及骨代謝相關(guān)基因[骨組織中堿性磷酸酶(Bone alkaline phosphatase, Balp),骨鈣素(Bone Gla Protein, Bglap),Ⅰvs2.86±0.19μmol/L,P<0.001)和COLⅠα1(20.21±0.91 ng/ml vs24.98±2.04 ng/ml, P<0.001)等反映成骨細胞活性的指標顯著降低,血清Ctsk(72.42±1.82μmol/L vs62.73±7.00μmol/L,P<0.05),Trap(40.63±2.43 U/L vs36.42±2.77 U/L,P<0.05)和CTX-1(2.74±0.33μmol/L vs2.19±0.42μmol/L,P<0.05)等反映破骨細胞活性的指標明顯升高.與Irp2 / 組小鼠相比,Irp2-/-組小鼠25-羥化酶(CYP2R1)(1.21±0.18 ng/mg vs1.94±0.14 ng/mg, P<0.001)活性和血清25羥維生素D3[25(OH)D3](25.63±0.98μmol/L vs28.40±1.66μmol/L,P<0.01)水平顯著降低.兩組間血鈣水平無明顯差異. 結(jié)論: 1 Irp2基因敲除可導致小鼠體內(nèi)鐵代謝紊亂及鐵分布異常(肝鐵沉積嚴重,骨鐵含量減少),小鼠骨組織內(nèi)鐵代謝相關(guān)基因及其蛋白的表達也發(fā)生了明顯變化,以代償Irp2-/-小鼠體內(nèi)的鐵代謝紊亂. 2兩組小鼠均發(fā)生骨質(zhì)疏松,Irp2-/-小鼠骨質(zhì)疏松程度更加嚴重. 3鐵代謝紊亂可加重骨質(zhì)疏松癥的發(fā)展.內(nèi)源性鐵過載引起的CYP2R1活性降低,以及后者引起的25(OH)D3水平降低,可能是Irp2-/-小鼠發(fā)生骨質(zhì)疏松的重要原因之一.

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? ?維生素D需經(jīng)過兩步的酶促反應(yīng)(25-羥基化作用和1α-羥基化作用),才能產(chǎn)生有活性的1α,25(OH)2D.其中,CYP2R1是生物體內(nèi)催化維生素D的25-羥基化作用的關(guān)鍵酶,該過程是活性維生素D合成的重要環(huán)節(jié).目前,國內(nèi)外對小鼠CYP2R1的認識還非常有限,其蛋白結(jié)構(gòu),理化性質(zhì)和病理學功能等也尚不清楚.此外,隨著維生素D缺乏癥的發(fā)生,維生素D的需求量增加,其生物學轉(zhuǎn)化也具有廣闊的應(yīng)用前景,因此,維生素D 25-羥基化酶CYP2R1的相關(guān)研究顯得尤為重要.本研究首先利用生物信息學軟件對小鼠CYP2R1序列進行分析,為小鼠CYP2R1理化性質(zhì)的研究及其定向改造提供參考;其次,克隆小鼠CYP2R1基因并在宮頸癌(Hela)細胞中進行表達,以構(gòu)建真核高表達載體,為活性維生素D的生物學轉(zhuǎn)化提供實驗基礎(chǔ);此外,通過細胞劃痕實驗,MTT檢測和qPCR檢測,初步探討小鼠CYP2R1對Hela細胞增殖的影響,為小鼠CYP2R1的相關(guān)功能研究提供了實驗基礎(chǔ).主要結(jié)Arg131,Arg138,Lys434,Lys435,Arg445,Arg455.以結(jié)構(gòu)明確的人CYP2R1為標準,比較了11個物種CYP2R1的二級結(jié)構(gòu);并以人CYP2R1結(jié)構(gòu)為模板,對小鼠CYP2R1進行了同源建模,比較了小鼠CYP2R1與人CYP2R1三級結(jié)構(gòu)的差異.(2)利用融合有His標簽的pcDNA3.1( )構(gòu)建了小鼠CYP2R1真核表達載體pcDNA3.1-CYP2R1,該載體能有效提高CYP2R1的mRNA和蛋白表達水平,其中mRNA水平提高了82524.59倍.(3)小鼠CYP2R1能夠同時上調(diào)細胞周期調(diào)控因子CyclinD1,P27和P21基因的表達,其中重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的CyclinD1和P27的相對表達量相比空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組具有極顯著差異(p0.01).推測CYP2R1參與了CyclinD1和P27對細胞周期的調(diào)控,但可能形成反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)CyclinD1-CDK-P27,導致Hela細胞的增殖變化不明顯.

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? ??研究背景維生素D(Vitamine D,VD)是皮膚經(jīng)紫外線照射后產(chǎn)生的一種類固醇激素。它除了在維持骨骼健康、調(diào)節(jié)鈣磷平衡方面發(fā)揮重要作用外,研究表明:維生素D受體還存在于子宮、卵巢、睪丸等生殖器官,在子宮內(nèi)膜及卵泡的生長發(fā)育、精子質(zhì)量優(yōu)劣方面發(fā)揮重要的生物學效應(yīng)。維生素D代謝通路基因CYP2R1、CYP27B1、CYP24A1、GC和維生素D受體(Vitamine D Receptor,VDR)的異常表達可能影響維生素D水平,從而影響生殖功能的發(fā)揮。1978世在英國誕生,此后輔助生殖技術(shù)(Assisted Reproduction Technique,ART)發(fā)展迅猛。隨著不孕癥發(fā)病率的逐年增加,輔助生殖技術(shù)越來越被大眾熟知和接受,但其臨床妊娠率遭遇瓶頸,徘徊在50。在許多研究中已經(jīng)報道了維生素D對臨床妊娠率和活產(chǎn)率的影響,但是研究結(jié)果并不一致,存在很大爭議。維生素D在不孕人群的分布及影響因素缺乏大數(shù)據(jù)研究,同時維生素D在ART過程中是否有明確作用仍然難以捉合并其他影響代謝的內(nèi)分泌疾病(如甲狀腺疾病、高催乳素血癥等);(3)子宮內(nèi)膜異位癥;(4)近半年內(nèi)補充維者,測定卵泡顆粒細胞中維生素D代謝通路相關(guān)基因m RNA表達。(2)分組情況:(1)根據(jù)血清25(OH)D水平,分成VD充足組(14例):25(OH)D≥75 nmol/L、VD不足組(23例):50 nmol/L<25(OH)D<75 nmol/L、VD缺乏組(32例):25(OH)D≤50 nmol/L。(2)根據(jù)多囊卵巢綜合征(